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熒光分光光度計測試的注意事項有哪些

發(fā)布日期: 2020-05-25
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  熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器
,有濾光片熒光計
、濾光片-單色器熒光計等,通常均由以下四個部分組成:激發(fā)光源
、用于選擇激發(fā)光波長和熒光波長的單色器
、樣品池及測量熒光的檢測器。熒光強(qiáng)度容易受外界因素的影響
,如樣品池
、激發(fā)光源
、溫度、溶液的pH值
、溶劑性質(zhì)
、其它溶質(zhì)、表面活性劑等都會造成熒光強(qiáng)度的變化
。嚴(yán)格控制測試條件對熒光分析來說至關(guān)重要
  ①樣品應(yīng)盛在四面透光的石英比色皿(熒光池)中
,如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池
  ②在熒光分析時
,為了得到穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)
,一般需要開機(jī)預(yù)熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈
,預(yù)熱時間可以縮短到10min左右。對某些易感光
、易分解的熒光物質(zhì)
,盡量采用長波長、低人射光強(qiáng)度及短時間光照
 ?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">、蹨囟茸兓梢馃晒鈴?qiáng)度的改變。通常降低溫度
,有利于提高熒光量子產(chǎn)率
,熒光強(qiáng)度增大。溫度影響熒光強(qiáng)度的顯著程度因樣品而異
,大部分熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溫度影響不大
,測試溫度變化不超過±3℃,對測試結(jié)果幾乎無影響
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、墚?dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時,溶液的pH對熒光強(qiáng)度有較大影響
。因為弱酸或弱堿在不同酸度中
,分子和離子的電離平衡會發(fā)生改變,而熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度會因其離解狀態(tài)發(fā)生改變
。以苯胺為例:在pH=7~12的溶液中會產(chǎn)生藍(lán)色熒光
,在pH<2或ph>13的溶液中都不產(chǎn)生熒光。再如
,維生素B2(核黃素)在430~440nm藍(lán)光照射下會發(fā)出綠色熒光
,λem為535nm
。它在pH=6~7的溶液中熒光強(qiáng)度大,而在pH=11時熒光消失
;但在堿性溶液經(jīng)光線照射發(fā)生分解作用或在酸性KMn04氧化下都會生成熒光強(qiáng)度比維生素B2強(qiáng)得多的黃光素
,并可溶于lv仿。利用此性質(zhì)可提高測定的靈敏度和選擇性
 ?div id="m50uktp" class="box-center"> 、莘肿咏Y(jié)構(gòu)中存在π-π共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中,熒光效率顯著增強(qiáng)
。溶液中表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強(qiáng)度
  ⑥瑞利散射和拉曼散射是溶劑的兩種散射光
,應(yīng)注意不要誤把瑞利散射和拉曼散射光譜當(dāng)做熒光光譜
。瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同,拉曼散射與激發(fā)光波長不同
,而熒光物質(zhì)的熒光波長與激發(fā)光波長無關(guān)
,因此可以通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長將拉曼散射光與熒光分開。在測試時選擇合適的狹縫寬度
,或者空白扣除
,也可以對散射光的影響進(jìn)行校正。
 ?div id="m50uktp" class="box-center"> 、邿晒馕镔|(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低
,常見的熒光猝滅劑,如鹵素離子
、重金屬離子
、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等
。溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)象
,因此,在較嚴(yán)格的熒光實驗中必須除02
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、鄿y試過程中注意不要肉眼盯著氙燈光源看,以防對眼睛造成損傷
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、醿x器房應(yīng)注意經(jīng)常通風(fēng),避免產(chǎn)生的臭氧在室內(nèi)富集
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